Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
В конической колбе готовят соответствующий объем концентрирующего геля с необходимой концентрацией акриламида, используя значения, указанные в Табл.
2.2.31.-2. Компоненты смешивают в обозначенной последовательности. Если необходимо, перед прибавлением раствора аммония персульфата и ТЕМЭД раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0.45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭД, как указано в Табл. 2.2.31.-2, взбалтывают (встряхивают вращательными движениями) и сразу заливают в пространство между двумя пластинками кассеты прямо на поверхность полимеризованного разделительного геля. В раствор концентрирующего геля сразу вкладывают чистый политетрафторэтиленовый гребень для избежания появления воздушных пузырьков. Прибавляют еще раствор концентрирующего геля до полного заполнения пространства гребня. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре до полимеризации.
Таблица 2.2.31 .-2
Приготовление концентрирующего геля
Компоненты раствора Объемы компонента (мл) на 1 кассету геля вместимостью
1мл 2мл 3мл 4мл 5мл 6мл 8мл 10мл
Вода Р 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
Раствор акриламида
(1)
w
0,17
0,33
0,5
0,67
0,83
1,0
1,3
1,7
1.0М Трис (рН 6.8)
(3)
0,13
0,25
0,38
0,5
0,63
0,75
1,0
1,25
Раствор 100 г/л ДСН
(4)
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,08
0,1
Раствор 100 г/л АПС
(5)
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,08
0,1
ТЕМЭД
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,008
0,01
(1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1) Р.
(2) 1.0М Трис (рН 6.8): 1.5М буферный раствор трис-гидрохлорида рН 6.8 Р.
(3) Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфоната Р.
(4) Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Аммония персульфат доставляет свободные радикалы, которые ускоряют полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата разлагается, следует готовить еженедельно свежие растворы
(5) ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин Р.__________________________________________________
Сборка электрофоретического прибора и проведение электрофоретического разделения. После завершения полимеризации (около 30 минут) осторожно удаляют политетрафторэтиленовый гребень. Сразу ополаскивают стенки водой или буферным рабочим раствором для электрофореза в системе ДСН-ПАГ Р для удаления излишков неполимеризованного акриламида. При необходимости поправляют выступ концентрирующего геля тупой гиподермичной иголкой, надетой на шприц. Снимают зажимы с одной короткой стороны, осторожно вытягивая трубку. Аналогично снимают зажимы с другой короткой стороны. Затем удаляют трубку со дна геля. Помещают гель в электрофоретичный прибор. Верхний и нижний резервуары наполняют буфером для электрофореза. Удаляют все пузырьки, образующиеся на поверхности геля между двумя стеклянными пластинками. Для этих целей лучше всего использовать иголку, надетую на шприц. Не следует проводить первоначальный электрофорез до нанесения образцов, так как это приведет к нарушению непрерывности буферной системы. Перед нанесением образцов осторожно ополаскивают отверстие буфрным рабочим раствором для электрофореза в системе ДСН-ПАГ Р. Готовят испытуемые растворы и растворы сравнения в рекомендованном буфере для образцов и обрабатывают, как указано в частной статье. Наносят необходимое количество каждого раствора в карманы концентрирующего геля. Начинают электрофорез в условиях, указанных в инструкции к прибору. Изготовители ДСН-ПАГ приборов могут поставлять гели разных размеров и толщины. Для получения оптимального разделения необходимо подбирать время проведения электрофореза, а также силу тока/напряжения соответственно с указанием изготовителя приборов.
Необходимо удостовериться, что окрашенный фронт доходит до разделительного геля. Когда краситель доходит до нижнего края геля, электрофорез заканчивают. Кассету геля вынимают из прибора и отделяют стеклянные пластинки. Вытаскивают прокладки, отрезают, отделяют концентрирующий гель и окрашивают полученный гель.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ В ГЕЛЯХ
Наиболее широко применяется метод окрашивания белков красителем Кумасси (# кислотный синий 92), позволяющий определить от 1 мкг до 10 мкг белков в одной полосе. Окрашивание серебром - наиболее чувствительный метод для окрашивания белков в гелях, при этом определяются полосы, содержащие от 10 нг до 100 нг белка.
Все стадии окрашивания геля проводят при комнатной температуре, осторожно встряхивая (например, на платформе шейкера) в подходящей посуде. При окрашивании гелей необходимо надевать рукавицы, так как на геле остаются отпечатки пальцев.
Краска Кумасси. Гель погружают в большой объем раствора краски Кумасси Р, выдерживают продолжительностью не менее 1 часа. Затем сливают раствор для окрашивания.
